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蘇丹紅：人工合成的系列偶氮類工業染料，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號。國際癌癥研究機構將蘇丹紅Ⅳ號列為三類致癌物，其初級代謝產物鄰氨基偶氮甲苯和鄰甲基苯胺均列為二類致癌物，均有一定的潛在致癌作用。
近年來歐盟和我國都嚴禁使用蘇丹紅作為食品添加劑，參考國家標準GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》，我們采用反相高效液相色譜儀對蘇丹紅I號、II號和IV號進行了測定。
1、 方法原理
樣品經溶劑提取、固相萃取凈化后，用反相高效液相色譜—紫外可見光檢測器進行色譜分析，采用外標法定量。
2、 主要儀器和試劑
1）【上分】牌高效液相色譜儀，二元高壓梯度；
2）電子天平；
3）超聲波水浴；
4）旋轉蒸發儀，5）離心機，6）蘇丹紅檢測專用固相萃取柱；
6）蘇丹紅標準儲備液：準確稱取適量蘇丹紅標準物質，用乙腈配制成10 µg/mL的標準貯備液待用。
3、 實驗方法
3.1樣品制備
3.1.1樣品提取準確稱取咸鴨蛋黃1.0g于三角瓶中，加入10mL正己烷，渦旋1min后振蕩5min，超聲5min，4000r/min離心5min，收集上清液。下層殘留物用10mL正己烷按上述步驟重復提取一次，合并兩次上清液，用旋轉蒸發儀濃縮至近干，再加入5 mL正己烷混勻，待用。
3.1.2 SPE柱凈化：
1）活化：蘇丹紅檢測柱使用前用10 mL正己烷活化；
2）上樣和洗脫：蘇丹紅檢測柱上加入待凈化液，棄去流出液；依次加入5 mL正己烷、5 mL 1%乙酸乙酯正己烷淋洗，棄去淋洗液；再加入10 mL 30%乙酸乙酯-正己烷溶液，收集洗脫液。（整個上樣洗脫過程均保持流速1 mL/min)
3）洗脫液在40 ℃下減壓蒸餾近干，加1mL 40%甲基叔丁基醚甲醇溶液定容，過0.45μm 濾膜后供HPLC分析。
3.2、高效液相色譜儀參考條件
色譜柱：C18 4.6 mm(i.d)×250mm，5μm；
梯度程序：流動相A: 乙腈 流動相B: 0.2%磷酸水溶液
|
功能 |
T(min) |
A(%) |
B(%) |
|
0 |
18 |
88 |
12 |
|
1 |
2 |
100 |
0 |
|
0 |
10 |
100 |
0 |
|
1 |
0.1 |
88 |
12 |
|
0 |
9.9 |
88 |
12 |
流速：1 mL/min；
柱溫：40℃波長：518 nm；
進樣體積: 20 μL
測定：取相同體積試樣制備液和標準使用液分別注入高效液相色譜儀，根據保留時間按定性，外標峰面積法定量。
4、 實驗結果
4.1 高效液相色譜圖
2.5 μg/mL 蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅IV混合標準樣品
1、蘇丹紅I 2、蘇丹紅II 3、蘇丹紅IV
4.2工作曲線的繪制
蘇丹紅I號工作曲線見下圖，線性相關系數：0.9997
5、 小結
實驗中前處理步驟選用專用的蘇丹紅萃取小柱，去油效果佳，能有效去除油酯等干擾，有較高的回收率和穩定性；采用二元高壓梯度，三種蘇丹紅組分有很好的分離效果和重復性。此方法也適用于其他食品基質中蘇丹紅的檢測。
